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Metagenome Sequencing
Metagenome Sequencing Metagenome Sequencing
在總體基因體學 (Metagenomics) 研究領域，Pacbio HiFi 定序特有的長讀取與高準確度雙重特性，使其能在複雜的微生物群體分析中提供更高的分辨率。囊括了可培養與不可培養的微生物，可減少部分組裝的錯誤，有效提高微生物群落的分辨率，並分析微生物多樣性、族群結構，再進一步探討與環境之間的關係。
自環境 ( 或培養 ) 樣品萃取 DNA 後，先將樣品 DNA 片段化至最適定序長度 (7~12kb)，接著製成啞鈴狀模板 (SMRTbell) 文庫，並於 PacBio Revio 平台進行定序與後續分析。
樣品條件
| DNA 檢體需求 | |
|---|---|
| 樣品型態 | DNA |
| 總量 | ≧ 10000 ng |
| 濃度 (Qubit) | ≧ 120 ng/ul |
| Qubit/Nanodrop ratio | 0.7~1.3 |
| 純度 | OD260/OD280 ≧ 1.7；OD260/OD230 ≧ 1.5 |
| 體積 | ≧ 85 ul |
| DNA 品質 | GQN10kb > 7.0 ; GQN30kb > 5.0 (Fragment Analyzer system) |
定序策略
- PacBio Revio Platform
分析流程及內容
PacBio SMRTLink 用於校正原始定序數據並生成 HiFi 序列。樣品拆分後，我們先使用 DIAMOND 進行轉譯式比對 (translational alignment)，將 HiFi 序列比對至 NCBI nr 蛋白質資料庫。接著，透過 MEGAN 的最低共同祖先 (lowest common ancestor, LCA) 演算法，為這些 HiFi 序列進行物種與功能註釋。最終輸出結果不僅包含絕對與標準化的物種豐度估算，也同時提供基於 InterPro2GO、SEED、EC 和 eggNOG 資料庫的功能註釋。另一方面，我們亦透過統計模型與互動式圖表，評估並可視化組內 (alpha) 與組間 (beta) 多樣性，最後整合成網頁報告。
Standard Analysis - 標準分析服務
Diversity analyses
- 分析結果為向量檔案格式，不失真且容易編輯。
- 提供敘述性統計和整體與胼對檢定結果，透過互動式表格可快速篩選出符合條件之結果。
Rarefaction curve
Observed features 和 Shannon's index 之運算結果
α diversity
6 種多樣性指數計算
β diversity
2 種多樣性指數計算
Taxonomic assignment
Barplot of taxonomic classification
互動式介面調整樣品排序和整體配色
Hierarchical Clustering Heatmap with Dendrograms
以物種之豐度進行樣品聚類熱圖繪製
Krona Interactive Pie Chart
以圓餅圖顯示樣品之物種組成
Heat Tree Plot
查看各分類階層之物種組成
Sankey plot
展示樣品菌種在各分類階層之變化
Differential abundance analysis
- 對不同組別差異性顯著影響之物種。
ANCOM-BC
(Analysis of Compositions of Microbiomes with Bias Correction)
駢對檢定，分析結果以火山圖顯示差異菌種，可以互動式介面調整參數。
LEfSe (Linear discriminant analysis Effect Size)
進行多組比較，分析結果以直條圖和分支圖呈現。
Functional analysis
- 基於 InterPro2GO、SEED、EC 和 eggNOG 資料庫的功能註釋。
- 提供敘述性統計和整體與胼對檢定結果，透過互動式表格可快速篩選出符合條件之結果。
Heatmap
顯示多組比較結果
Forest plot
顯示駢對比較結果
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