16S full length rDNA Sequencing 16S full length rDNA Sequencing

自樣品萃取之細菌 DNA，利用 1-Step PCR 擴增全長 16S rDNA (V1-V9) 區域的片段，同時於 5‘ 端連接特定的 Barcode 序列。隨後，將雙股 PCR 產物接上 PacBio 特殊設計的髮夾彎序列，製備成啞鈴狀模板 (SMRTbell) 文庫，並於 PacBio Sequel IIe 平台進行定序。

檢體需求

DNA QC 標準：
樣品種類	純菌 DNA	含 host DNA
總量 (Qubit, dsDNA)	≥150 ng	≥300 ng
體積	≥15 µL	≥15 µL
濃度	≥10 ng/uL	≥20 ng/uL
品質 (TapeStation)	major peak ≥ 10kb	major peak ≥ 10kb

定序策略

1. PacBio Sequel IIe Platform
2. 每樣品 10,000 HiFi Reads

分析流程

PacBio SMRTLink 被用於校正定序下機的原始數據並生成 CSS reads。Q 值達到 Q20 的 CCS reads 被定義為 HiFi reads。樣品拆分後，我們去除了序列中的樣品標籤和非生物鹼基的接合子 (adapter)。接著，我們根據序列的錯誤率和長度篩選掉低品質序列，並將保留之序列它們校正為一致的方向，然後運行 DADA2 演算法降噪，以獲得 ASVs (Amplicon Sequence Variants) 的特徵序列。

我們使用了三個資料庫，包括 NCBI 16S ribosomal RNA sequences (BioProject 33175 和 33317 的 RefSeq 記錄)，Genome Taxonomy Database (GTDB) 和 SILVA database20，並使用 Naive Bayesian Classifier 對這些 ASVs 進行物種註釋。此外，我們還利用親緣關係樹估算組內 (alpha) 和組間 (beta) 的多樣性，結合不同統計模型的結果和互動式圖表，生成網頁報告。