ChIP-ON-CHIP

免疫沉澱晶片服務 ChIP-on-chip Microarray Service

基因表現是生物體內一個複雜的程序,牽涉了許多蛋白質交互作用,而傳統 mRNA 基因表現分析僅能得到有限關於 transcription 的資料,DNA 層次的調控則無法得知。 ChIP-on-chip 為分析 DNA 層次最具突破性的技術,利用Chromotin Immunoprecipitation 結合 Microarray 高通量特性,可一次分析全基因體與特定 transcription factor 或 DNA binding protein 產生交互作用的 DNA 位點,關聯到代表的基因群,進一步了解基因的表現與調控。另也可應用在 Epigenomics 相關研究,如 CpG island 甲基化 (DNA Methylation) 及 Chromatin 結構的緊致度分析 (Histone Midification) 所形成之基因表現調控開關。

Agilent Microarray Features Agilent 已對常見模式生物設計專屬的啟動子晶片 (Promoter array),包括人類、小鼠、大鼠、班馬魚、阿拉伯芥。而對於基因組比較小的生物如酵母菌、線蟲、果蠅等更有 whole genome tiling array。目前 Agilent ChIP on chip 晶片已被廣泛應用及被包含 Richard Young 等國際知名學者,發表在 Cell、Nature、Science 等期刊上面。而除了上述物種外,威健可對任何具序列資料庫物種設計客制化 Tiling Array,提供您最好的服務。


目前人類啟動子晶片 (Promoter array) 之探針設計涵蓋轉錄起始點上游 5.5 kb 至下游 2.5 kb,每個探針約間隔 200 bp 佈放,具有下列特性:

  1. 60 mer oligo 長度探針大幅提升雜交反應專一性以及靈敏度
  2. 合適的探針佈放間距以達到單位成本最高密度實驗結果
  3. 探針設計之特異性經最高規格標準篩選
  4. eArray 客制化平台提供使者針對特定基因、特定染色體區域設計自已專屬的晶片,研究範疇更可延伸至任何具序列資料庫的物種。另外,威健已設計好一款結合 Promoter array 與 CpG Island array 的整合性實用 Microarray,已有許多學者採用。

威健提供的服務以接續 chromatin IP 後的 Microarray 實驗為主;包含 WGA 放大(視需要)、螢光標定、晶片 hybridization、資料基本整理與分析等。前端 chromatin IP 須由客戶自行進行,由於各家條件各異,難以規格化,目前威健無法提供該服務。


詳細規格

Agilent 晶片種類 晶片格式 Probes/Array Composition Probe resolution
Human ENCODE ChIP-on-chip Microarray 1 x 244K 153,000+ UCSC ENCODE No data
Human Promoter ChIP-on-chip Microarrays 1 x 244K (x2) ~17,000 UCSC hg18 (NCBI Build 36.1) March-2006 Set covers -5.5kb upstream to +2.5kb downstream of the transcriptional start sites
Mouse Promoter Microarray Kit, 2-Design Set, 1x244K 1 x 244K (x2) ~17,000 UCSC mm8 (NCBI Build 36) Set covers -5.5kb upstream to +2.5kb downstream of the transcriptional start sites
SurePrint G3 Human Promoter 1x1M Kit 1 x 1M Distinct Biological Features :966092
Internal Quality Control: 7924
~21,000 of the best-defined Human genes as represented by RefSeq
UCSC hg19 (NCBI Build 36), February 2009
178 bp overall median probe spacing
SurePrint G3 Human Promoter 2x400K Kit 2 x 400K Distinct Biological Features : 414043
Internal Quality Control: 6245
~21,000 of the best-defined Human genes as represented by RefSeq
UCSC hg19 (NCBI Build 36), February 2009
172 bp overall median probe spacing
SurePrint G3 Mouse Promoter 1x1M Kit 1 x 1M Distinct Biological Features : no data
Internal Quality Control: 6009
~19,000 of the best-defined Mouse genes as represented by RefSeq
200 bp overall median probe spacing
UCSC mm9 (NCBI Build 37), July 2007
SurePrint G3 Mouse Promoter 2x400K Kit 2 x 400K Distinct Biological Features : 415814
Internal Quality Control: 4474
~19,000 of the best-defined Mouse genes as represented by RefSeq
193 bp overall median probe spacing
UCSC mm9 (NCBI Build 37), July 2007
Model Organism ChIP-on-chip Microarrays
Arabidopsis Genome Microarray Kit, 2-Design Set, 1x244K     Arabidopsis Ath2 Tiled across whole Arabidopsis genome with 212 nt average spacing
C. elegans Genome Microarray Kit, 2-Design Set, 1x244K     C. elegan Ce2 Tiled across whole Arabidopsis genome with 212 nt average spacing
Drosophila Genome Microarray Kit, 2-Design Set, 1x244K     Drosophila DM2 Tiled across whole Drosophila genome with 233 nt average spacing
S. pombe Genome Microarray, 1x244K     ~85% of the non-repetitive portion of the S. pombe genome (~12.5 MB) Average probe spatial resolution is ~290 nt
Yeast Genome Microarray Kit (S. cerevisiae )     S. cerevisiae sacCer1 Average probe spatial resolution is ~290 nt (4 x 44K slide format) or ~50 nt (1 x 244K slide fornat)
Zebrafish Promoter Microarray Kit, 2-Design Set, 1x244K     Zebrafish zv4 Probes tiled across Zebrafish promoter regions representing 11,000 transcripts

如有其他物種需求,請參見 Agilent 網站資訊。各模式物種可依需要另以 Custom Microarray 方式,製做成共同一片晶片以減少誤差。

樣品條件

檢體類別:total RNA 、Tissue、Cell line

RNA QC 標準:
  檢體 檢體量
1. IP 後的 DNA ≧200 ng
2. genomic DNA 0.2 μg ~ 1 μg
  • 請以 QPCR 驗證數個已知有結合位點。
  • 若 DNA 量不足以定量或進行 QPCR 驗證,建議進行 WGA 放大後進行。

實驗流程

流程說明
詳細 SOP 請下載 Agilent 建議
客戶端製備 chromatin-immunoprecipitation-DNA
準備 5x107 ~ 1x108 細胞,以 formaldehyde 處理細胞中已 cross-link 蛋白質及核酸
磁珠與 ChIP 抗體結合
溶解細胞,以超音波將 chromatin 片段化至長度 200bp-500bp 後,進行 chromatin-immunoprecipitation 實驗,解除 cross-link,並純化DNA
以 QPCR 驗證 IP 後的 DNA 上數個已知之結合位點,確認 ChIP 實驗成功。
ChIP-DNA 、 Input-DNA 及基因特異引子送交威健實驗室
2100 Bioanalyzer 確認 DNA 長度分布(一般量不會太多僅有微小突起)
若 DNA 量不足 200 ng,以 WGA kit 進行放大 (視需要)
螢光標定:片斷化 DNA 進行螢光標定,實驗組的 DNA 標定 Cy5 螢光,對照組 DNA 標定 Cy3
晶片實驗:實驗組 DNA 與對照組 DNA 雜交反應,Wash 晶片後進行晶片掃描。
Data 輸出,並分析 binding element,初次委託者由專責人員到場說明

報告內容

ChIP-on-chip 服務及報告內容

報告產出 說明 格式
原始數據 Scanning image Combined Cy3,Cy5 Image TIFF
Raw data Feature Extraction 軟體輸出 txt
Design file 所用晶片原始 design file xml
以分析軟體協助輸出之數據 Raw data 原始訊號數值 Excel
Normalized ratio ( 經 rank consistent lowess 方法進行 normalization) 統計分析 Excel
p -value( 以 error model 進行 t- test 分析,以供 differential expressed gene 之判斷 ) 統計分析 Excel

Reference

  1. Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells. Laurie A. Boyer et al., (2006), Nature 441(18), 349-53.
  2. Core Transcriptional Regulatory Circuitry in Human Embryonic Stem Cells. Laurie A. Boyer et al., (2005), Cell 122(6), 947-956.
  3. Comprehensive Analysis of Heterochromatin- and RNAi-Mediated Epigenetic Control of the Fission Yeast Genome. Hugh P. Cam et al., (2005), Nat Genet. 37(8), 809-819.
  4. Control of Developmental Regulators by Polycomb in Human Embryonic Stem Cells. Tong Ihn Lee, et al. (2006), Cell 125(2), 301-313.
  5. Activated Signal Transduction Kinases Frequently Occupy Target Genes. Dmitry K. Pokholok, Julia Zeitlinger, Nancy M. Hannett, David B. Reynolds, and Richard A. Young (2006) Science 313(5786), 533-536.
  6. Genome-wide Map of Nucleosome Acetylation and Methylation in Yeast. Dmitry K. Pokholok et al., (2005), Cell 122(4), 517-527.
  7. Swi6/HP1 Recruits a JmjC Domain Protein to Facilitate Transcription of Heterochromatic Repeats. Martin Zofall and Shiv I.S. Grewal, (2006), Molecular Cell. 22 (5), 681–692.
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