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ChIP-ON-CHIP
免疫沉澱晶片服務 ChIP-on-chip Microarray Service
基因表現是生物體內一個複雜的程序，牽涉了許多蛋白質交互作用，而傳統 mRNA 基因表現分析僅能得到有限關於 transcription 的資料，DNA 層次的調控則無法得知。ChIP-on-chip 為分析 DNA 層次最具突破性的技術，利用 Chromotin Immunoprecipitation 結合 Microarray 高通量特性，可一次分析全基因體與特定 transcription factor 或 DNA binding protein 產生交互作用的 DNA 位點，關聯到代表的基因群，進一步了解基因的表現與調控。另也可應用在 Epigenomics 相關研究，如 CpG island 甲基化 (DNA Methylation) 及 Chromatin 結構的緊致度分析 (Histone Midification) 所形成之基因表現調控開關。
Agilent Microarray Features Agilent 已對常見模式生物設計專屬的啟動子晶片 (Promoter array)，包括人類、小鼠、大鼠、班馬魚、阿拉伯芥。而對於基因組比較小的生物如酵母菌、線蟲、果蠅等更有 whole genome tiling array。目前 Agilent ChIP on chip 晶片已被廣泛應用及被包含 Richard Young 等國際知名學者，發表在 Cell、Nature、Science 等期刊上面。而除了上述物種外，威健可對任何具序列資料庫物種設計客制化 Tiling Array，提供您最好的服務。
目前人類啟動子晶片 (Promoter array) 之探針設計涵蓋轉錄起始點上游 5.5kb 至下游 2.5kb，每個探針約間隔 200bp 佈放，具有下列特性：
- 60 mer oligo 長度探針大幅提升雜交反應專一性以及靈敏度
- 合適的探針佈放間距以達到單位成本最高密度實驗結果
- 探針設計之特異性經最高規格標準篩選
- eArray 客制化平台提供使者針對特定基因、特定染色體區域設計自已專屬的晶片，研究範疇更可延伸至任何具序列資料庫的物種。另外，威健已設計好一款結合 Promoter array 與 CpG Island array 的整合性實用 Microarray，已有許多學者採用。
威健提供的服務以接續 chromatin IP 後的 Microarray 實驗為主；包含 WGA 放大 ( 視需要 )、螢光標定、晶片 hybridization、資料基本整理與分析等。前端 chromatin IP 須由客戶自行進行，由於各家條件各異，難以規格化，目前威健無法提供該服務。
詳細規格
| Agilent 晶片種類 | 晶片格式 | Probes/Array | Composition | Probe resolution |
|---|---|---|---|---|
| Human ENCODE ChIP-on-chip Microarray | 1 x 244K | 153,000+ | UCSC ENCODE | No data |
| Human Promoter ChIP-on-chip Microarrays | 1 x 244K (x2) | ~17,000 | UCSC hg18 (NCBI Build 36.1) March-2006 | Set covers -5.5kb upstream to +2.5kb downstream of the transcriptional start sites |
| Mouse Promoter Microarray Kit, 2-Design Set, 1x244K | 1 x 244K (x2) | ~17,000 | UCSC mm8 (NCBI Build 36) | Set covers -5.5kb upstream to +2.5kb downstream of the transcriptional start sites |
| SurePrint G3 Human Promoter 1x1M Kit | 1 x 1M | Distinct Biological Features :966092 Internal Quality Control: 7924 |
~21,000 of the best-defined Human genes as represented by RefSeq UCSC hg19 (NCBI Build 36), February 2009 |
178 bp overall median probe spacing |
| SurePrint G3 Human Promoter 2x400K Kit | 2 x 400K | Distinct Biological Features : 414043 Internal Quality Control: 6245 |
~21,000 of the best-defined Human genes as represented by RefSeq UCSC hg19 (NCBI Build 36), February 2009 |
172 bp overall median probe spacing |
| SurePrint G3 Mouse Promoter 1x1M Kit | 1 x 1M | Distinct Biological Features : no data Internal Quality Control: 6009 |
~19,000 of the best-defined Mouse genes as represented by RefSeq 200 bp overall median probe spacing |
UCSC mm9 (NCBI Build 37), July 2007 |
| SurePrint G3 Mouse Promoter 2x400K Kit | 2 x 400K | Distinct Biological Features : 415814 Internal Quality Control: 4474 |
~19,000 of the best-defined Mouse genes as represented by RefSeq 193 bp overall median probe spacing |
UCSC mm9 (NCBI Build 37), July 2007 |
| Model Organism ChIP-on-chip Microarrays | ||||
| Arabidopsis Genome Microarray Kit, 2-Design Set, 1x244K | Arabidopsis Ath2 | Tiled across whole Arabidopsis genome with 212 nt average spacing | ||
| C. elegans Genome Microarray Kit, 2-Design Set, 1x244K | C. elegan Ce2 | Tiled across whole Arabidopsis genome with 212 nt average spacing | ||
| Drosophila Genome Microarray Kit, 2-Design Set, 1x244K | Drosophila DM2 | Tiled across whole Drosophila genome with 233 nt average spacing | ||
| S. pombe Genome Microarray, 1x244K | ~85% of the non-repetitive portion of the S. pombe genome (~12.5 MB) | Average probe spatial resolution is ~290 nt | ||
| Yeast Genome Microarray Kit (S. cerevisiae ) | S. cerevisiae sacCer1 | Average probe spatial resolution is ~290 nt (4 x 44K slide format) or ~50 nt (1 x 244K slide fornat) | ||
| Zebrafish Promoter Microarray Kit, 2-Design Set, 1x244K | Zebrafish zv4 | Probes tiled across Zebrafish promoter regions representing 11,000 transcripts | ||
如有其他物種需求，請參見 Agilent 網站資訊。各模式物種可依需要另以 Custom Microarray 方式，製做成共同一片晶片以減少誤差。
樣品條件
檢體類別：total RNA、Tissue、Cell line
| RNA QC 標準： | ||
|---|---|---|
| 檢體 | 檢體量 | |
| 1. | IP 後的 DNA | ≧200 ng |
| 2. | genomic DNA | 0.2 μg ~ 1 μg |
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實驗流程
| 流程說明 詳細 SOP 請下載 Agilent 建議 |
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|---|---|---|
客戶端製備 chromatin-immunoprecipitation-DNA |
準備 5x107 ~ 1x108 細胞，以 formaldehyde 處理細胞中已 cross-link 蛋白質及核酸 | |
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磁珠與 ChIP 抗體結合 | |
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溶解細胞，以超音波將 chromatin 片段化至長度 200bp-500bp 後，進行 chromatin-immunoprecipitation 實驗，解除 cross-link，並純化 DNA | |
| 以 QPCR 驗證 IP 後的 DNA 上數個已知之結合位點，確認 ChIP 實驗成功。 | ||
ChIP-DNA、Input-DNA 及基因特異引子送交威健實驗室 |
2100 Bioanalyzer 確認 DNA 長度分布 ( 一般量不會太多僅有微小突起 ) | |
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若 DNA 量不足 200 ng，以 WGA kit 進行放大 ( 視需要 ) | |
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螢光標定：片斷化 DNA 進行螢光標定，實驗組的 DNA 標定 Cy5 螢光，對照組 DNA 標定 Cy3 | |
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晶片實驗：實驗組 DNA 與對照組 DNA 雜交反應，Wash 晶片後進行晶片掃描。 |
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| Data 輸出，並分析 binding element，初次委託者由專責人員到場說明 | ||
報告內容
ChIP-on-chip 服務及報告內容
| 報告產出 | 說明 | 格式 | |
|---|---|---|---|
| 原始數據 | Scanning image | Combined Cy3,Cy5 Image | TIFF |
| Raw data | Feature Extraction 軟體輸出 | txt | |
| Design file | 所用晶片原始 design file | xml | |
| 以分析軟體協助輸出之數據 | Raw data | 原始訊號數值 | Excel |
| Normalized ratio ( 經 rank consistent lowess 方法進行 normalization ) | 統計分析 | Excel | |
| p -value ( 以 error model 進行 t- test 分析，以供 differential expressed gene 之判斷 ) | 統計分析 | Excel |
Reference
- Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells. Laurie A. Boyer et al., (2006), Nature 441(18), 349-53.
- Core Transcriptional Regulatory Circuitry in Human Embryonic Stem Cells. Laurie A. Boyer et al., (2005), Cell 122(6), 947-956.
- Comprehensive Analysis of Heterochromatin- and RNAi-Mediated Epigenetic Control of the Fission Yeast Genome. Hugh P. Cam et al., (2005), Nat Genet. 37(8), 809-819.
- Control of Developmental Regulators by Polycomb in Human Embryonic Stem Cells. Tong Ihn Lee, et al. (2006), Cell 125(2), 301-313.
- Activated Signal Transduction Kinases Frequently Occupy Target Genes. Dmitry K. Pokholok, Julia Zeitlinger, Nancy M. Hannett, David B. Reynolds, and Richard A. Young (2006) Science 313(5786), 533-536.
- Genome-wide Map of Nucleosome Acetylation and Methylation in Yeast. Dmitry K. Pokholok et al., (2005), Cell 122(4), 517-527.
- Swi6/HP1 Recruits a JmjC Domain Protein to Facilitate Transcription of Heterochromatic Repeats. Martin Zofall and Shiv I.S. Grewal, (2006), Molecular Cell. 22 (5), 681–692.
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